Toen de Duitse troepen in mei 1940 Nederland binnenvielen, vertrok koningin Wilhelmina naar Engeland en bleef Paleis Het Loo achter zonder bewoners. Het duurt niet lang voordat de Duitse bezetter interesse toont in Paleis Het Loo. Op 27 juni 1940 inspecteren SS-officieren Kurt Baron von Schröder en Karl Bockamp de inventaris van Het Loo. En op 9 april 1941 neemt de Wehrmacht zijn intrek in de beide zijvleugels van Paleis Het Loo. Enkele dagen later wordt de lange laan voor het paleis gerenoveerd. Het noordelijke deel wordt beplant met nieuwe beukenbomen. Het uitgestrekte paleispark kreeg tijdens de oorlog een geheel nieuwe functie. De Duitsers zagen het terrein als strategisch waardevol door de ligging tussen de Veluwe en belangrijke verkeersroutes. Er verrezen wachthuisjes, versperringen en luchtafweerposities; delen van het park werden ingericht als oefenterrein en opslagplaats. Voor de inwoners van Apeldoorn betekende dit dat het vertrouwde bosgebied veranderde in een militair gecontroleerde zone, waar toegang beperkt werd en patrouilles het dagelijkse beeld bepaalden.
Tegelijkertijd namen Duitse instanties zoals de Reichsforstverwaltung het beheer van het landgoed over. Zij voerden plannen uit voor houtkap, wildstandbeheer en herstel van lanen en waterpartijen. Hoewel deze maatregelen vooral waren ingegeven door militaire en economische motieven, zorgden ze ervoor dat grote delen van het landschap van Het Loo verrassend intact bleven gedurende de oorlogsjaren. De impact van de bezetting werd in Apeldoorn overal zichtbaar. In januari 1943 vond de razzia en deportatie van patiënten en personeel van de Joodse psychiatrische instelling Het Apeldoornsche Bosch plaats. Duitse eenheden trokken via de wegen langs het Loo richting het station, waar de deportatietreinen vertrokken. Daarnaast werden mensen uit de regio ingezet voor werkzaamheden op en rond het paleisterrein, soms vrijwillig uit noodzaak, soms onder dwang, bijvoorbeeld bij aanleg en onderhoud van Duitse verdedigingswerken.
Vanaf september 1944 veranderde de situatie opnieuw. Het front kwam dichterbij, Canadese troepen naderden, en Duitse eenheden trokken zich door de bossen rond Het Loo terug. Het paleis liep schade op door plundering en vernieling; enkele vertrekken stonden leeg of waren door soldaten in gebruik genomen. Toch bleven grote militaire confrontaties rond het paleis uit. Op 17 april 1945 bevrijdden Canadese troepen Apeldoorn zonder grote gevechten. De Duitsers trokken zich ordelijk terug en lieten Het Loo achter in sterk verwaarloosde staat. Twee dagen later vestigt prins Bernard zich met zijn militaire staf op Het Loo. Het paleis wordt het hoofdkwartier van de Nederlandse Strijdkrachten. Pas in de herfst van 1945 kan een begin gemaakt worden met de herinrichting van het paleis. De Tweede Wereldoorlog heeft zijn sporen nagelaten op Paleis Het Loo.